寡核苷酸藥物是人工合成的具有10~30個(gè)核苷酸組成的單鏈或雙鏈RNA或DNA藥物，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)作用于mRNA或其前體pre-mRNA并阻斷其表達(dá)，從而抑制蛋白質(zhì)生成，目前已有上百個(gè)臨床項(xiàng)目在世界范圍內(nèi)開展[1]，主要用于治療罕見、疑難疾病，如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、乙型肝炎等。寡核苷酸藥物具有特異性強(qiáng)、基因靶點(diǎn)豐富、療效持久等特點(diǎn)，有望成為繼小分子藥物和抗體藥物之后的第三代藥物。
與小分子藥物和抗體藥物以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)不同，科學(xué)家基于中心法則，針對(duì)“致病蛋白”為不可成藥靶標(biāo)的情況，通過(guò)干擾“致病蛋白”的生成，開發(fā)了以反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide, ASO)，小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)，微小RNA (micro-RNA, miRNA)和核酸適配體(Aptamer)等為代表的寡核苷酸藥物，旨在通過(guò)干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程以控制靶標(biāo)蛋白的生成，從而治療疾病。
圖1 中心法則”三步曲”（圖片來(lái)自于網(wǎng)絡(luò)）
為了便于廣大同仁更全面的了解該類新藥，本文重點(diǎn)從寡核苷酸藥物的獲批情況、作用機(jī)制、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、藥理學(xué)、成藥性等方面展開討論，擬在充分了解這些信息的基礎(chǔ)上為臨床前及臨床評(píng)價(jià)策略的制定提供科學(xué)、全面、有效的數(shù)據(jù)與理論支持，以期推動(dòng)人類大健康產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量穩(wěn)步快速發(fā)展。
上篇鏈接：新藥浪潮之寡核苷酸藥物（上）
- 化學(xué)修飾和遞送系統(tǒng)
寡核苷酸藥物成藥性的實(shí)現(xiàn)主要克服了包括但不限于藥物穩(wěn)定性（未受保護(hù)的ASO在約30分鐘內(nèi)被血漿中的3'至5'核酸外切酶降解，而細(xì)胞內(nèi)核酸酶在＜10分鐘內(nèi)將其分解）、穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)靶標(biāo)（寡核苷酸分子帶負(fù)電荷、親水性，血漿蛋白結(jié)合率低，易被腎臟快速過(guò)濾并在尿液中排出，且難通過(guò)細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層）、防止脫靶（對(duì)靶標(biāo)親和力差）等問題，藥物結(jié)構(gòu)方面在優(yōu)化序列設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，著重進(jìn)行了化學(xué)修飾和選用遞送系統(tǒng)等方面的改進(jìn)。
- 化學(xué)修飾
對(duì)于寡核苷酸分子結(jié)構(gòu)的修飾，主要從其三個(gè)官能團(tuán)磷酸骨架、糖和堿基著手考慮，從以下方面來(lái)提高藥理藥效：一是提高藥物對(duì)核酸酶的抗性；二是增加與靶向mRNA的結(jié)合力；三是調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合率，使其在不被快速清除的前提下穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮藥理作用；四是降低免疫原性；五是降低毒性。至今，寡核苷酸藥物修飾已經(jīng)從第一代發(fā)展到第三代[2]，詳見表4（根據(jù)E. Doxakis. Med Res Rev., 2020: 1–33整理）。
表4 ASO藥物化學(xué)修飾
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代序 |
修飾方式 |
優(yōu)點(diǎn) |
待改進(jìn)方面 |
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第一代 |
硫代磷酸（PS）主鏈：通過(guò)用硫（S）原子取代磷酸基團(tuán)中的一個(gè)非橋接氧原子來(lái)制備的 |
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N3'-磷酸酰胺：3'OH基團(tuán)被胺取代。 |
與PS相比
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硼磷酸 |
幾乎不用于增強(qiáng)RNase H1 核酸酶穩(wěn)定性的修飾。 |
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第二代 |
2'-O-甲基（2'-OMe） |
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阻礙RNase H1酶切割靶RNA |
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2'-O-甲氧基乙基（2'-MOE） |
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鎖定核酸（LNA）：4‘碳通過(guò)亞甲基橋連接到2’羥基 |
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有毒性 |
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2'-氟（2'-F） |
與2'-OMe相比，
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S-限制-乙基（cEt）橋接核酸（BNA）（cEt-BNA） |
將2'-MOE和LNA的結(jié)合，
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三環(huán)脫氧核糖核酸（tc‐DNA） |
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第三代 |
磷酸二酰胺嗎啉（PMO）：具有取代呋喃糖環(huán)的嗎啉環(huán)和取代帶負(fù)電荷磷酸二酯酶骨架的中性磷酸二酰胺骨架 |
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血漿蛋白結(jié)合率低，易被腎臟迅速清除，因此，需要更高的劑量，或與肽結(jié)合以提高細(xì)胞攝取。 |
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肽核酸（PNA）：有一個(gè)由N-（2-氨基乙基）甘氨酸組成的肽骨架，取代了糖磷酸鹽骨架。 |
盡管與核酸的正常結(jié)構(gòu)存在很大差異，
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其他對(duì)糖的修飾 |
無(wú)水乙醇核酸（HNAs）：由磷酸化的2,3-二脫氧-D-阿拉伯糖醇單元組成 |
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環(huán)己烯核酸（CeNAs）：呋喃糖部分被環(huán)己烯環(huán)取代 |
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D-阿糖醇核酸（ANAs）：，由磷酸化的D-阿糖醇骨架組成 |
核堿基插入碳水化合物部分的2'-位。它在結(jié)構(gòu)上與HNA的不同之處在于在3'-α-位存在一個(gè)補(bǔ)充羥基，這意味著阿糖醇部分的3'碳采用（S）-構(gòu)型，
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經(jīng)測(cè)試，與單獨(dú)的2'-OMe寡核苷酸相比，其活性或穩(wěn)定性沒有任何顯著改善。 |
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其他對(duì)堿基的修飾 |
胞嘧啶（C）第5位的甲基 |
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胞嘧啶（C）第5位的5-丙炔基C |
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2，6二氨基嘌呤修飾 |
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2-硫代T修飾 |
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圖5 ASO藥物中應(yīng)用的化學(xué)修飾（E. Doxakis. Med Res Rev., 2020: 1–33）
- 遞送系統(tǒng)
寡核苷酸藥物到達(dá)靶位需要進(jìn)入靶細(xì)胞，除了可以通過(guò)化學(xué)修飾改變其與細(xì)胞表面蛋白的結(jié)合，以內(nèi)吞的形式到達(dá)靶位發(fā)揮藥效外，還可以通過(guò)遞送系統(tǒng)將被天然或合成載體包裹或結(jié)合的寡核苷酸藥物傳遞到特定組織中的靶細(xì)胞，以免于被降解、巨噬細(xì)胞吞噬等。這些載體包括病毒和非病毒載體。病毒載體由于其安全性、成藥性和成本等原因限制了其臨床應(yīng)用。而非病毒載體由于其低毒、納米尺寸和多功能性優(yōu)勢(shì)等已經(jīng)被應(yīng)用于siRNA藥物中。五款已上市siRNA藥物中，一款使用脂質(zhì)納米粒（LNP），四款使用N-乙酸半乳糖胺（GalNAc）綴合物進(jìn)行遞送，五款藥物均為靶向肝細(xì)胞的遞送系統(tǒng)。
與小分子藥物的LNP劑型只需要在到達(dá)靶組織后釋放負(fù)載的藥物相比，核酸類藥物的LNP劑型還須促進(jìn)這些大分子進(jìn)入靶細(xì)胞的胞內(nèi)遞送。
圖6 LNP遞送RNA藥物機(jī)制（圖片來(lái)自于網(wǎng)絡(luò)）
藥物Onpattro的脂質(zhì)納米粒（LNP）由靜脈注射給藥后，載脂蛋白E（ApoE）吸附到LNP表面增強(qiáng)了LNP對(duì)于肝臟的非凡親和力（尤其是對(duì)肝細(xì)胞），與粒子相連的ApoE作為高效的靶向配體通過(guò)連接肝細(xì)胞表面的脂蛋白受體觸發(fā)通過(guò)內(nèi)吞作用攝取進(jìn)肝細(xì)胞。由于內(nèi)涵體pH值較低，可解離的脂質(zhì)發(fā)生質(zhì)子化，與帶負(fù)電荷的內(nèi)源性脂質(zhì)相互作用，導(dǎo)致核內(nèi)體膜的不穩(wěn)定，并向細(xì)胞質(zhì)釋放siRNA發(fā)揮藥理作用。
GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶聯(lián)修飾是當(dāng)前最常用的小核酸藥物遞送系統(tǒng)。將 N-乙酰化的半乳糖胺（GalNAc）以三價(jià)態(tài)的方式共價(jià)綴合到不同序列的 siRNA 的正義鏈 3′末端，形成多糖-siRNA 單綴合物，GalNAc 是唾液酸受體（ASGPR）的靶向性配體，其與肝臟表面細(xì)胞具有較高的親和力和迅速內(nèi)化能力。GalNAc 與肝細(xì)胞表面的 ASGPR 結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)涵體，從而將足夠數(shù)量的 siRNA 帶入細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)向肝細(xì)胞的特異性遞送，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用使藥物進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能。
圖7 GalNAc-siRNA藥物遞送機(jī)制（圖片來(lái)自于網(wǎng)絡(luò)）
siRNA藥物研發(fā)中可應(yīng)用或嘗試的非病毒載體遞送系統(tǒng)除經(jīng)典陽(yáng)離子脂質(zhì)載體LNP外，還包括智能型陽(yáng)離子脂質(zhì)載體（環(huán)境敏感性、靶向修飾性等）、陽(yáng)離子聚合物（如天然殼聚糖（CS）及其衍生物等）、無(wú)機(jī)納米粒（如金納米粒（AuNPs）、氧化鐵納米粒、碳納米管（CNTs）和二氧化硅納米粒（SiNPs）等）、siRNA的綴合物載體（除GalNAc綴合物外，還包括細(xì)胞穿透肽（CPP）綴合物等）、仿生載體（外泌體（Ex）、RNA納米載體（RNPs）、紅細(xì)胞膜修飾的納米載體）等，遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)策略特別需要重點(diǎn)關(guān)注的是：具備組織和細(xì)胞靶向、內(nèi)體逃逸、安全性等功能，以及開發(fā)新型生物材料等，這對(duì)于siRNA藥物從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化至關(guān)重要[3]。
- 結(jié)語(yǔ)
隨著寡核苷酸藥物的發(fā)展，其藥物研發(fā)流程亦逐漸完善，一般包括[4]：疾病發(fā)病機(jī)制研究，疾病相關(guān)靶向RNA的鑒定，RNA候選藥物的篩選?序列優(yōu)化?遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)與研究?藥理活性確認(rèn)、臨床前和臨床研究（藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)）等?本文總結(jié)概述了已獲批寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、作用機(jī)制以及成藥性等方面的研究進(jìn)展，后續(xù)請(qǐng)繼續(xù)關(guān)注寡核苷酸藥物的臨床前研究（藥代動(dòng)力學(xué)（PK）、藥效學(xué)（PD）和安全性評(píng)價(jià)）及生物樣品分析等相關(guān)內(nèi)容的總結(jié)。
匯智泰康是一家位于中美兩地的生物醫(yī)藥合同研發(fā)機(jī)構(gòu)，整合中美兩地的藥物研發(fā)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證，面向全球企業(yè)及研發(fā)機(jī)構(gòu)提供分析化學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)（DMPK）、藥理藥效、生物學(xué)、以及毒理安全性評(píng)價(jià)產(chǎn)品與服務(wù)。
- 參考文獻(xiàn)
[1] 周宇，王士奇，孫濤等. 日本藥品和醫(yī)療器械管理局《寡核苷酸治療產(chǎn)品 非臨床安全性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》指南介紹. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 2022, 38(22): 2788-2792.
[2] E. Doxakis. Therapeutic antisense oligonucleotides for movement disorders[J]. Med Res Rev., 2020: 1–33.
[3] 陶鈺萍, 趙珍玉2, 李又欣等. siRNA 新型非病毒載體遞送策略新進(jìn)展[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2023, 54(4): 471-480.
[4] 王恒,李華,汪溪潔,等.小核酸藥物非臨床特點(diǎn)和藥理毒理評(píng)價(jià)策略[J].中國(guó)新藥雜志, 2022, 31(12): 9.
