01 什么是彗星試驗？
當各種誘因引起細胞DNA鏈斷裂時，細胞裂解液可以使細胞內除核DNA外的物質擴散至電解液，留在原位的DNA在堿性電解質條件下解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放，電泳時帶負電荷的DNA向正極遷移形成"彗星"狀圖像，未受損傷的DNA保持球形。通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可以測定單個細胞DNA損傷程度。
02 什么情況下需要做彗星試驗？
1) 新藥申報
新藥申報時，對藥物遺傳毒性研究所采用的標準試驗組合二：一項細菌回復突變試驗，一項嚙齒類動物造血細胞微核試驗和第二項體內試驗（彗星試驗、轉基因小鼠體內突變試驗、DNA 共價結合試驗）。
2) 新化學物質申報
新化學物質申報時，當所提交的三項體外致突變存在陽性結果時，根據不同的遺傳終點，選擇對應或不同遺傳終點的體內致突變試驗，如彗星試驗、UDS試驗等。
3) 農藥申報、化妝品原料申報
如農藥申報、化妝品原料申報過程中，可能進行的體內遺傳檢測，以及其他需要進行彗星試驗的情況。
03 如何做彗星試驗？
目前常采用的試驗類型為哺乳動物體內堿性彗星試驗，在沒有特定靶器官的條件下，主要通過動物肝臟評估被測物DNA損傷能力，參考的指導原則主要為OECD TG489，或不同的國標進行檢測，如GB 31655-2021等。
對于哺乳動物體內堿性彗星試驗，通常會設溶媒對照組、陽性對照組及3個受試物組。50只SD大鼠，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。對于短期給藥受試物一般最高限值為2000 mg/kg，對于給藥14天或更長時間的試驗，如果能耐受，限度劑量為1000 mg/kg。陽性對照物一般選擇甲基磺酸乙酯（EMS），染毒劑量為200 mg/kg。各組動物分別在 0 h、24 h、45 h經口灌胃染毒。所有動物在末次染毒后3小時內進行安樂死，取肝臟中葉細胞制作玻片，經裂解、解旋、電泳后，染色觀察。
目前市場上已有成品化的彗星試驗試劑盒，國產品牌如匯智和源生物技術（蘇州）有限公司生產的彗星試劑盒等，進口品牌如Trevigen的Comet Assay Kit等，試劑盒基本包含了試驗除染色液外的基礎試劑和玻片，整體試驗流程制定基本符合OECD要求，能幫助試驗更加快速和順利的完成。
04 如何分析彗星試驗的結果？
使用彗星分析軟件進行分析，每只動物觀察并分析150個細胞（不含刺猬細胞）的尾DNA含量百分率（尾DNA%），尾長以及尾矩，并使用個體動物的中位值計算組間平均值。分析組間尾DNA%差異，判定受試物引起的DNA斷裂程度。判定標準可參考OECD TG489的要求。
05 注意事項和常見問題
1) 陽性對照物的選擇
根據OECD和國標相關系列標準，推薦陽性對照物如下：
|
化學物及CAS.號 |
靶器官 |
|
甲磺酸乙酯 EMS (CAS 62-50-0) |
所有組織 |
|
乙基亞硝基脲 (CAS 759-73-9) |
肝、胃、十二指腸、空腸 |
|
甲磺酸甲酯 MMS (CAS 66-27-3) |
肝、胃、十二指腸、空腸、肺及支氣管肺泡細胞 腎、膀胱、睪丸、骨髓造血系統(tǒng) |
|
N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍 (CAS 70-25-7) |
胃、十二指腸、空腸 |
|
二甲基肼吡啶 (CAS 306-37-6) |
肝、腸 |
|
甲基亞硝基脲 (CAS 684-93-5) |
肝、骨髓、血細胞、腎、胃、空腸、腦 |
2) 背景數據
建議每個實驗室在開展彗星試驗之前，建立自己的背景數據庫，包括陰性和陽性對照數據。在JaCVAM所進行的國際驗證報告中，不同實驗室所得到的彗星試驗結果不盡一致，如陰性對照結果尾DNA%范圍在0-8.6之間，因此在有一定的背景數據之上，才能對所得到的實驗數據進行更好的判斷，減少假陽性或假陰性的判定概率。
3) 操作過程
單細胞懸液：制備鋪膠用的單細胞懸液時，細胞數量建議在1×105～4×105個/mL，或根據實驗室經驗自行調整，過多的細胞在后期鏡下觀察時會產生細胞的重疊，導致無法分析，數量過少則可供分析數量可能不足。特別需要注意的是，陽性對照組的單細胞懸液數量在使用時，需要再進一步的稀釋，防止重疊現(xiàn)象。
脫膠問題：脫膠屬于彗星試驗過程中常見的問題，在裂解、電泳過程中都可能發(fā)生，主要從以下幾個方面預防，首先，電泳膠在使用前，一定要確保充分的熔化，使用過程中的保持溫度可稍高一些，比如40℃，防止因降溫過快導致固化；其次在鋪膠過程中，盡量快速準確，保證涂膠均勻，在使用試劑盒提供的帶孔玻片時，可對玻片預熱，鋪膠時保證膠液邊緣能與孔的邊緣充分接觸，從而依靠表面張力將膠面固定；最后，在裂解和電泳過程中，盡量不要直接觸碰膠面，不要將液體直接傾倒至膠面處，以免將膠面沖脫。
染色問題：染色液可根據各個實驗室配備的熒光顯微鏡來選擇，常見的有SYBR Gold、SYBR Green I、Gelred、GeneRed、碘化丙啶或溴化乙錠等，值得注意的是，染色完畢后，可嘗試再用PBS或超純水清洗一次玻片，防止染色過度導致背景著色過重，這個步驟可以在實驗室建立背景數據中的模擬試驗中嘗試。
06 結果展示
匯智泰康在CNAS-GLP體系下，根據OECD指導原則進行了十余項彗星試驗的檢驗檢測，列舉了部分檢測結果如下：
|
受試物/劑量 |
組別/性別 |
動物編號 |
尾DNA% |
|
|
個體動物（n=150細胞） |
平均值±SD （n=5/性別/組） |
|||
|
超純水，0 mg/kg體重 |
1/M |
1 |
4.35 |
3.73±1.84 |
|
2 |
3.05 |
|||
|
3 |
4.59 |
|||
|
4 |
0.91 |
|||
|
5 |
5.73 |
|||
|
EMS，200 mg/kg體重 |
2/M |
6 |
31.81 |
31.83±6.14** |
|
7 |
35.95 |
|||
|
8 |
33.84 |
|||
|
9 |
36.25 |
|||
|
10 |
21.32 |
|||
|
xxx，500 mg/kg體重 |
3/M |
11 |
3.47 |
5.96±2.18 |
|
12 |
5.84 |
|||
|
13 |
8.35 |
|||
|
14 |
4.20 |
|||
|
15 |
7.94 |
|||
|
xxx，1000 mg/kg體重 |
4/M |
16 |
1.86 |
1.44±0.75 |
|
17 |
2.13 |
|||
|
18 |
1.28 |
|||
|
19 |
0.21 |
|||
|
20 |
1.72 |
|||
|
xxx，2000 mg/kg體重 |
5/M |
21 |
4.23 |
7.22±3.47 |
|
22 |
7.89 |
|||
|
23 |
12.94 |
|||
|
24 |
5.83 |
|||
|
25 |
5.22 |
|||
附圖
正常細胞（無明顯拖尾） 倍數：20x
細胞拖尾（彗星）倍數：20x
刺猬細胞 倍數：20x
|
1/M TS |
1/F TS |
|
|
|
備注：HE染色，10X，肝臟，未見異常改變
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